Trang chủ Kiến thứcChăn nuôi Nano bạc chống vi rút gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi-Giải pháp an toàn

Nano bạc chống vi rút gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi-Giải pháp an toàn

Nano Power
Xuất bản: Cập nhật 310 views

Bệnh dịch tả lợn Châu Phi hay còn gọi là ASF, ngay từ khi phát hiện ra bệnh, các nhà khoa học vẫn chưa tìm ra vắc xin điều trị. Virus có khả năng tồn tại lâu dài trong môi trường, đường lây truyền đa dạng, khó kiểm soát. Gây thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi. Các hạt nano bạc đã được nghiên cứu và cho thấy có hiệu quả như một chất kháng vi-rút tiềm năng chống lại vi-rút dịch tả lợn Châu Phi.

Các hạt nano Bạc (SNP) gần đây đã nổi lên như một chất kháng vi-rút mới chống lại nhiều loại vi-rút, nhưng hoạt tính kháng vi-rút của chúng đối với ASFV vẫn chưa được nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, khả năng kháng virus của SNP đối với ASFV đã được báo cáo.

Tổng quan

Virus gây bệnh dịch tả lợn châu Phi (ASFV) là nguyên nhân gây ra một căn bệnh rất dễ lây lan và gây tử vong ở lợn nuôi, nhưng cho đến nay vẫn chưa có vắc-xin hoặc thuốc hiệu quả, vì vậy việc tìm ra một loại thuốc chống ASFV mới và hiệu quả là một nhiệm vụ cấp thiết.

Các hạt nano Bạc (SNP) gần đây đã nổi lên như một chất kháng vi-rút mới chống lại nhiều loại vi-rút, nhưng hoạt tính kháng vi-rút của chúng đối với ASFV vẫn chưa được nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, khả năng kháng virus của SNP đối với ASFV đã được báo cáo. Sự ô nhiễm vi sinh vật trong chuồng lợn đã giảm đáng kể bằng cách phun 25 ppm SNP. Dung dịch SNP với nồng độ 0,78 ppm không có bất kỳ độc tính nào đối với tế bào đại thực bào phế nang của lợn; đồng thời ức chế hoàn toàn ASFV ở 103 HAD50 (liều hấp phụ hồng cầu).

Nghiên cứu này xác nhận rằng nano bạc có khả năng chống lại ASFV cao và là một chất khử trùng đầy hứa hẹn có thể được sử dụng để ngăn ngừa lây truyền ASFV.

Nha Trang: Phát hiện ổ dịch bệnh tả lợn châu Phi

Giới thiệu

Virus gây bệnh dịch lợn châu Phi (ASFV) là một trong loại virus của giống Asfivirus trong họ Asfarviridae, một loại virus DNA sợi đôi có hình thái tứ diện phức tạp [1]. ASFV gây bệnh do Virus ở lợn với tỷ lệ tử vong rất cao ở lợn nhà, trong khi bệnh này không có triệu chứng ở vật chủ béo tự nhiên.

Virus có thể được truyền qua tiếp xúc trực tiếp với động vật bị nhiễm bệnh, qua vết cắn của động vật chân đốt bị nhiễm bệnh, đặc biệt là các loài ve mềm thuộc giống Ornithodoros, và khi tiếp xúc với vật liệu hoặc vật liệu. Bị nhiễm vi rút như thịt, máu hoặc dịch chưa nấu chín từ lợn bị nhiễm bệnh [2 -4]. Virus này tồn tại rất lâu trong máu và các mô sau khi chết nên rất dễ lây nhiễm qua đường vận chuyển các sản phẩm từ thịt lợn. Virus có thể được tìm thấy trong tất cả các chất tiết, đặc biệt là trong dịch mũi. Sự lây truyền qua đường không khí cũng xảy ra ở chuồng lợn [3].

Dịch bệnh bùng phát có thể gây ảnh hưởng kinh tế đáng kể đối với khu vực bị ảnh hưởng, tiêm chủng là biện pháp kiểm soát tốt nhất, nhưng rất tiếc cho đến nay vẫn chưa có vắc xin nào được bán ra thị trường. Sự phát triển của vắc-xin đã bị cản trở bởi những khoảng trống lớn trong việc hiểu biết về lây nhiễm ASFV, khả năng miễn dịch và cơ chế mà Virus điều chỉnh phản ứng của vật chủ đối với sự lây nhiễm [5]. Không có vắc-xin chống lại ASFV, chẩn đoán sớm và các biện pháp vệ sinh hiệu quả là những chiến lược rất quan trọng để loại bỏ bệnh ở vùng bị ảnh hưởng.

Vì chưa có vắc xin nên việc thực hiện các biện pháp an toàn sinh học vẫn là chìa khóa để kiểm soát và phòng chống dịch bệnh. Ngoài các quy định nghiêm ngặt về vận chuyển động vật và sản phẩm động vật, quản lý chất thải liên quan đến thịt lợn và giám sát các khu vực bị nhiễm bệnh, thực hành khử trùng hiệu quả đóng một vai trò rất quan trọng. kiểm soát dịch bệnh lây lan [6-8].

ASFV bị bất hoạt bởi pH <3,9 hoặc> 11,5 và một số chất khử trùng truyền thống như canxi hydroxit, hypochlorite, formalin, ortho-phenylphenol, Glutaraldehyde và các hợp chất iốt [6, 9]. Các chất khử trùng truyền thống thường gây ra một số nhược điểm như có mùi hôi, làm mất nhanh hoạt tính kháng virus và khả năng gây ung thư; do đó, chỉ một số chất khử trùng nhất định được Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ khuyến nghị sử dụng trong cuộc chiến chống lại ASFV [9].

Những nỗ lực đáng kể gần đây đã được thực hiện để tìm ra các chất kháng vi-rút hiệu quả hơn, đặc biệt là những chất có nguồn gốc tự nhiên, với hy vọng phát triển một loại thuốc hiệu quả để điều trị bệnh dịch này hoặc chất kháng vi-rút để khử trùng [5, 10, 11]. Resveratrol và Oxyresveratrol có nguồn gốc thực vật (được tìm thấy trong vỏ nho, quả việt quất, quả mâm xôi và đậu phộng) để đối phó với căng thẳng sinh học và phi sinh học có thể ức chế nhiễm vi-rút bằng cách phá vỡ các chức năng. của các ô [1].

Genistein thể hiện hoạt tính kháng ASFV-Ba71V mạnh nhất với hiệu giá virus giảm 3,8 log ở nồng độ 50 mM và 8 hpi [12]. Hoạt động kháng vi rút của Genistain trên chủng ASFV Ba71V đã được xác định bằng một số cách bao gồm suy giảm tổng hợp DNA của vi rút, ức chế các giai đoạn sau xâm lấn của vòng đời ASFV và ức chế hoạt động của enzym. ASFV loại II topoisomerase. Các polysaccharid được sulfat hóa có thể ức chế sự hấp phụ của virus trên tế bào vật chủ [13].

Apigenin, một flavonoid tự nhiên được tìm thấy trong nhiều loại thực vật có thể ức chế sự tổng hợp protein đặc hiệu của ASFV và làm giảm sự hình thành virus ASFV 99,99% bằng cách thêm 1 giờ sau khi cấy [14]. Fluoroquinolones được phát hiện có ảnh hưởng đến sự sao chép DNA của virus và quá trình tổng hợp protein ASFV làm gián đoạn quá trình lây nhiễm virus [15]. Một nhóm chất ức chế HDAC có thể loại bỏ sự sao chép của ASFV-Ba71V và tổng hợp protein muộn [16]. Mặc dù đã rất cố gắng nhưng trên thị trường vẫn chưa có loại thuốc nào hiệu quả để điều trị bệnh; Do đó, việc tìm ra một chất khử trùng hiệu quả với khả năng kháng virus cao vẫn là một thách thức.

Các hạt nano bạc (SNP) đã được sử dụng rộng rãi như một chất khử trùng trong các ứng dụng từ vệ sinh hàng ngày đến y học [17-21]. Gần đây, vật liệu nano bao gồm các hạt nano đã nổi lên như một loại tác nhân điều trị mới có thể ức chế sự nhân lên của virus [22-24]. Người ta tin rằng SNP, đặc biệt là các hạt có đường kính nhỏ hơn 10 nm, có thể tương tác với các nhóm lưu huỳnh hoạt động trong các nút glycoprotein gp120 gây ra sự ức chế lây nhiễm vi rút suy giảm miễn dịch ở người (HIV-1) [25-27] và các tương tác tương tự có thể được tìm thấy ở mụn rộp vi rút simplex loại 1 (HVS-1) [28], vi rút cúm A [29-31] và vi rút cúm. H3N2 [32].

SNPs mạnh hơn các hạt nano vàng, nhưng không cho thấy độc tính tế bào cấp tính đối với Hut / CCR5 và các tế bào đơn nhân máu ngoại vi của con người, đồng thời ức chế sự nhân lên của HIV-1 [33]. Các chất ổn định được sử dụng để tổng hợp SNP cũng ảnh hưởng đến hoạt động kháng virus của chúng; có thể có hoạt tính kháng virus cao hơn đối với RSV khi SNP được ổn định bởi curcumin so với axit citric [34]. Sau HIV-1, người ta đã chứng minh rằng SNP có thể tương tác và ức chế nhiều loại virus khác gây bệnh do virus cho người như HVS-1 và 2 [28, 35], viêm gan B [36], virus hợp bào hô hấp (RSV) [ 37], cúm A H1N1 [29] [31], và cúm H3N2 [32], parainfluenza ở người loại 3 [38], poliovirus [39], và adenovirus loại 3 [40].

Một số nghiên cSự lây lan của ASFV ở châu Âu, Trung Quốc và một số quốc gia khác gây thiệt hại lớn về kinh tế và đe dọa bình ổn lương thực trên toàn thế giới [45-52], tuy nhiên, việc kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh vẫn dựa trên các biện pháp an toàn sinh học do thiếu vắc-xin và thuốc. Vì vậy, nhu cầu về một tác nhân kháng virus hiệu quả để chống lại căn bệnh đang lây lan là rất cao và cấp thiết. SNP đã có hoạt tính kháng vi rút cao đối với nhiều loại vi rút, nhưng khả năng chống vi rút của chúng đối với ASFV vẫn chưa được nghiên cứu.

Do đó, trong nghiên cứu này, hoạt tính kháng Virus của nano Bạc chống lại ASFV sẽ được kiểm tra để đánh giá việc sử dụng chúng trong việc kiểm soát lây truyền ASFV đã điều tra hoạt tính kháng Virus của các hạt nano bạc trong các bệnh do Virus ở động vật và chỉ ra rằng SNP có thể ức chế hiệu quả vi-rút Tacaribe ở dơi [41], Virus truyền nhiễm gây ra bệnh gumboro ở gà [42] và Virus viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGEV) có thể gây nặng tiêu chảy ở lợn [43]. SNP gắn grapheme oxide cũng cho thấy khả năng kháng vi rút cao chống lại vi rút gây ra hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV) được gọi là bệnh lợn tai xanh và vi rút tiêu chảy ở lợn (PEDV) [44].

Sự lây lan của ASFV ở châu Âu, Trung Quốc và một số quốc gia khác gây thiệt hại lớn về kinh tế và đe dọa an ninh lương thực trên toàn thế giới [45-52], tuy nhiên, việc kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh vẫn dựa trên các biện pháp an toàn sinh học do thiếu vắc-xin và thuốc. Vì vậy, nhu cầu về một tác nhân kháng virus hiệu quả để chống lại căn bệnh đang lây lan là rất cao và cấp thiết. SNP đã có hoạt tính kháng vi rút cao đối với nhiều loại vi rút, nhưng khả năng chống vi rút của chúng đối với ASFV vẫn chưa được nghiên cứu. Do đó, trong nghiên cứu này, hoạt tính kháng vi rút của nano nano chống lại ASFV sẽ được kiểm tra để đánh giá việc sử dụng chúng trong việc kiểm soát lây truyền ASFV.

Kinh nghiệm

Tổng hợp hạt nano

SNPs được tổng hợp bằng các phương pháp khử hóa học như được mô tả ở những nơi khác [53]. Trong một thí nghiệm điển hình, 20 mL chitosan 10000 ppm làm chất ổn định lần đầu tiên được thêm vào cốc 1000 mL có chứa 180 mL nước cất dưới sự khuấy ở tốc độ 300 vòng / phút. Sau khi dung dịch trở nên đồng nhất; Khoảng 10 phút khuấy liên tục, 250 mL dung dịch AgNO3 1000 ppm được thêm vào và hỗn hợp được khuấy với tốc độ như nhau trong 1h. Sau đó, thí nghiệm được tiếp tục bằng cách tăng tốc độ khuấy lên 500 vòng / phút và thêm 200 ppm dung dịch NaBH4 (20 mL) làm chất khử bằng phương pháp nhỏ giọt. Ngay sau khi nhỏ dung dịch NaBH4, dung dịch trong cốc chuyển sang màu vàng và sẫm lại khi cho chất khử vào. Thí nghiệm kết thúc khi quá trình thêm NaBH4 kết thúc. Các NP bạc thu được được chuyển vào các chai mẫu màu nâu và giữ ở điều kiện phòng để điều tra thêm.

Nghiên cứu về tính chất khử trùng

Sau khi ủ ở 37°C trong 1 giờ, huyền phù (100 µL) được lấy và pha loãng bằng nước cất vô trùng với mười độ pha loãng liên tiếp và sau đó 100 L của mỗi độ pha loãng được chiết và sắp xếp trên đĩa NA, ủ trong 24 h ở 37°C đối với khuẩn lạc đếm. Thí nghiệm đối chứng được thực hiện theo phương pháp tương tự nhưng nước cất tiệt trùng được thêm vào thay vì dung dịch SNPs.

Chỉ số ô nhiễm vi sinh trong chuồng heo được khảo sát bằng phương pháp thụ động gọi là phương pháp tấm lắng. Theo đó, môi trường PCA chứa các đĩa Petri (đường kính 9 cm) được đặt ở 4 góc và tâm chuồng heo, cách sàn 40 cm và cách tường hoặc chướng ngại vật 1 m và tiếp xúc với không khí trong 10 phút. Thí nghiệm bắt đầu với việc chuẩn bị mặt bằng, trong đó sàn được làm sạch bằng nước và để khô cho đến khi thử nghiệm tấm lắng.

Nuôi cấy tế bào và chuẩn bị Virus

Đại thực bào phế nang sơ cấp của lợn (PAM) được thu thập từ phổi của lợn 6–8 tuần, nặng 20–40 kg và lợn Trắng Lớn khỏe mạnh. Tế bào phế nang được nuôi cấy trong môi trường RPMI với 10% huyết thanh lợn và 1% kháng sinh. Đối với nuôi cấy đơn lớp, tế bào phế nang được cấy vào đĩa nhựa nuôi cấy mô ở khoảng 4105 tế bào / cm2. Sau 24 giờ ở 37°C trong không khí ẩm với 5% CO2, các tế bào không kết dính được loại bỏ bằng cách rửa sạch bằng môi trường.

VNUA / HY-ASF1, vi rút p72 kiểu gen II có nguồn gốc từ lợn bị nhiễm bệnh tại một trang trại ở tỉnh Hưng Yên, Việt Nam, được chiết tách và nuôi cấy lên 106 HAD50 (Liều hấp phụ hồng cầu). ) như đã báo cáo trong một nghiên cứu trước đây, được sử dụng cho cuộc điều tra này [51].

Kiểm tra độc tính tế bào

Các hạt nano bạc (500 ppm) được pha loãng thành các nồng độ khác nhau từ 0,024 ppm đến 50 ppm để thực hiện kiểm tra độc tính tế bào. Trước đó, các tế bào PAM đã được gieo vào các đĩa 96 giếng đã được gạn lọc để loại bỏ môi trường, sau đó thêm 50 µL SNP pha loãng và 50 µL canh RPMI vào mỗi giếng. Nồng độ NP bạc cuối cùng trong thiết bị đồng nhất tế bào được tính bằng cách chia nồng độ SNP loãng thêm vào giếng cho 2 do sự pha loãng (1: 1). Sau đó, các đĩa này được ủ trong khoảng 1 giờ ở 37°C trong môi trường 5% CO2 và sau đó 200 µL môi trường tươi được thêm vào để theo dõi khả năng sống của tế bào. Các tế bào chết và sống được xác định bằng cách xác định hình thái của chúng sau khi xử lý bằng nano bạc. Những con sống có hình cầu và rõ ràng giống như những con trong đối chứng, trong khi những con chết bị thu nhỏ và đôi khi có dạng hình cầu hoặc vỡ vụn.

Kiểm tra sự ngăn chặn vi rút

Để kiểm tra hoạt tính ức chế của SNP đối với vi rút, hạt nano có nồng độ không độc hại cao nhất đã được chọn và trộn với dịch nổi của vi rút theo tỷ lệ thể tích 1: 1. Trong một thí nghiệm điển hình, chất chuẩn độ 106 virus HAD50 được pha loãng bằng môi trường sử dụng mười độ pha loãng loạt trước khi trộn với dung dịch SNP. Phần nổi phía trên của virus, sau khi trộn với SNPs, được giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ cho các thí nghiệm tiếp theo.

Sau đó, các thí nghiệm được thực hiện bằng cách thêm 100 µL dung dịch chứa cả SNP và virus ở các hiệu giá khác nhau vào các giếng tế bào sau khi loại bỏ môi trường. Đối chứng được chuẩn bị bằng cách chỉ nuôi cấy tế bào trong môi trường và chỉ thêm virut. Đĩa được ủ ở 37 ° C trong 5% CO2 trong khoảng 8 giờ để virus sống sót tái tạo. Sau khi ủ, hỗn hợp virus và SNPs được loại bỏ khỏi tế bào và rửa sạch bằng dung dịch PBS 1X và sau đó thêm môi trường 200 µL bổ sung 1% hồng cầu lợn.

Cuối cùng, các tế bào được ủ ở 37 ° C trong 7 ngày và được kiểm tra trên kính hiển vi để đánh giá sự phát triển của chúng dựa trên sự thay đổi về hình dạng và sự hình thành tiểu hành tinh đặc trưng đại diện cho quá trình hấp tiệt trùng. Các thụ thể hồng cầu xung quanh các tế bào bị nhiễm bệnh. Hoạt tính kháng vi rút của SNP được xác định dựa trên khả năng tồn tại của các tế bào ở cấp độ nghiên cứu trong trường hợp không có hiệu ứng tế bào (CPE).

Kết quả và thảo luận

Dung dịch AgNO3 chuyển sang màu vàng ngay sau khi thêm dung dịch NaBH4 chứng tỏ có khả năng tạo thành SNP. Hiện tượng này có thể liên quan đến hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt đặc trưng của các NP bạc. Đặc tính quang phổ UV-Vis cho thấy sự hấp thụ đạt cực đại ở bước sóng 401 nm (Hình 1 A), trùng với bề mặt cộng hưởng Plasmon của SNP được báo cáo trong nhiều công trình trước đây [25, 54, 55]. Dung dịch tối quan sát được khi thêm dung dịch NaBH4 là do nồng độ SNP tăng, tỷ lệ với cường độ hấp thụ. Điều này đã được chứng minh trong các nghiên cứu trước đây [56, 57], trong đó sự tiến hóa của SNP được theo dõi bằng cách sử dụng phổ UV-Vis được thu thập tại các thời điểm phản ứng khác nhau.

Vị trí của đỉnh hấp thụ có thể thay đổi một chút trong các nghiên cứu khác nhau do ảnh hưởng của kích thước và hình dạng hạt nano; tuy nhiên, đây là một phương pháp dễ dàng để đánh giá ban đầu nhanh chóng về sự hình thành SNP. Để xác nhận thêm sự hiện diện của SNP, hình ảnh TEM có độ phân giải cao (Hình 1 B) đã được thực hiện để phân tích kích thước, hình dạng và độ tinh thể của chúng. Phân tích hình ảnh TEM cho thấy các hạt thu được có hình cầu với đường kính trung bình xấp xỉ 14 nm. Các hạt này có độ kết tinh cao với khoảng cách d là 0,23 nm (hình bên trong 1B), tương ứng với mặt phẳng (111) của bạc kim loại. Kết quả này chứng tỏ SNP kim loại đã được tổng hợp thành công và có thể được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Các đặc tính kháng khuẩn của các hạt nano tổng hợp đã được thử nghiệm chống lại Salmonella ở các nồng độ khác nhau từ 0,025 đến 250 ppm và kết quả được thể hiện trong Hình 2 và 3. Các mẫu đối chứng không có SNP bổ sung chứa 1,23 × 10 ^ 8. Trong khi đó, CFU / mL không tìm thấy vi khuẩn trong mẫu được xử lý SNP ở nồng độ trên 25 ppm (Hình 2). Như đã thấy trong Hình 3, SNP có thể ức chế hơn 95% vi khuẩn salmonella ở nồng độ SNP là 2,5 ppm và đạt 100% ở nồng độ SNP là 25 ppm.

Hiệu quả kháng khuẩn dường như phụ thuộc vào nồng độ, giảm từ 100% xuống 44,7% khi nồng độ SNP giảm tương ứng từ 25 xuống 0,025 ppm. Cơ chế giải thích các đặc tính kháng khuẩn của SNP vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ, nhưng có sự đồng thuận rộng rãi rằng SNP có thể ức chế vi khuẩn thông qua ba cơ chế: (1) Các ion Ag + làm gián đoạn quá trình sản xuất ATP và sao chép DNA, (2) Các ion SNP và Ag + tạo ra các gốc tự do oxy dư thừa như O, OH (ROS) làm phá vỡ màng và chức năng của ty thể hoặc gây tổn thương DNA, và (3) SNP tương tác và phá vỡ màng tế bào vi khuẩn [18]. Kết quả cho thấy SNP là một chất kháng khuẩn hiệu quả và có thể là một chất khử trùng tiềm năng chống lại ASFV.

Kết quả nghiên cứu của nano bạc

Dung dịch AgNO3 chuyển sang màu vàng ngay sau khi thêm dung dịch NaBH4 chứng tỏ có khả năng tạo thành SNP. Hiện tượng này có thể liên quan đến hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt đặc trưng của các NP bạc. Các đặc tính của quang phổ UV-Vis cho thấy sự hấp thụ đạt cực đại ở bước sóng 401 nm (Hình 1 A), trùng với bề mặt cộng hưởng Plasmon của SNP đã được báo cáo trong nhiều công trình trước đây.

Dung dịch tối quan sát được khi thêm dung dịch NaBH4 là do nồng độ SNP tăng, tỷ lệ với cường độ hấp thụ. Điều này đã được chứng minh trong các nghiên cứu trước đây [56, 57], trong đó sự tiến hóa của SNP được theo dõi bằng cách sử dụng phổ UV-Vis được thu thập tại các thời điểm phản ứng khác nhau. Vị trí của đỉnh hấp thụ có thể thay đổi một chút trong các nghiên cứu khác nhau do ảnh hưởng của kích thước và hình dạng hạt nano; tuy nhiên, đây là một phương pháp dễ dàng để đánh giá ban đầu nhanh chóng về sự hình thành SNP.

Để xác nhận thêm sự hiện diện của SNP, hình ảnh TEM có độ phân giải cao (Hình 1 B) đã được thực hiện để phân tích kích thước, hình dạng và độ tinh thể của chúng. Phân tích hình ảnh TEM cho thấy các hạt thu được có hình cầu với đường kính trung bình xấp xỉ 14 nm. Các hạt này có độ kết tinh cao với khoảng cách d là 0,23 nm (hình bên trong 1B), tương ứng với mặt phẳng (111) của bạc kim loại. Kết quả này chứng tỏ SNP kim loại đã được tổng hợp thành công và có thể được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

TEM image and UV spectrum of nanosilver

Các đặc tính kháng khuẩn của các hạt nano bạc tổng hợp đã được thử nghiệm chống lại Salmonella ở các nồng độ khác nhau từ 0,025 đến 250 ppm và kết quả được thể hiện trong Hình 2 và 3. Các mẫu đối chứng không có SNP bổ sung chứa 1,23 × 108. Trong khi đó, CFU / mL không tìm thấy vi khuẩn trong mẫu được xử lý SNP ở nồng độ trên 25 ppm (Hình 2). Như đã thấy trong Hình 3, SNP có thể ức chế hơn 95% vi khuẩn salmonella ở nồng độ SNP là 2,5 ppm và đạt 100% ở nồng độ SNP là 25 ppm.

Hiệu quả kháng khuẩn dường như phụ thuộc vào nồng độ, giảm từ 100% xuống 44,7% khi nồng độ SNP giảm tương ứng từ 25 xuống 0,025 ppm. Cơ chế giải thích các đặc tính kháng khuẩn của SNP vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ, nhưng có sự đồng thuận rộng rãi rằng SNP có thể ức chế vi khuẩn thông qua ba cơ chế: (1) Các ion Ag + làm gián đoạn quá trình sản xuất ATP và sao chép DNA, SNP và các ion Ag + tạo ra các gốc tự do oxy dư thừa như O, OH (ROS) làm phá vỡ màng và chức năng của ty thể hoặc gây tổn thương DNA, và (3) SNP tương tác và phá vỡ màng tế bào vi khuẩn. Kết quả cho thấy nano bạc là một chất kháng khuẩn hiệu quả và có thể là một chất khử trùng tiềm năng chống lại ASFV.

Antimicrobial ability of nano silver against Salmonella

Hình 2. Khả năng kháng khuẩn của SNPs chống lại Salmonella; khuẩn lạc từ mẫu đối chứng được pha loãng ở 106 lần (A) và mẫu được xử lý bằng SNPs 25 ppm được pha loãng ở 10 lần (B), và độ nhiễm vi sinh được kiểm tra bằng phương pháp đĩa lắng; khuẩn lạc phát triển trên đĩa thạch tiếp xúc với không khí 10 phút trước (C) và sau khi (D) phun SNPs 25 ppm

Expression of general understanding of nano bacillus bacillus Salmonella

Hình 3. Hiệu quả kháng khuẩn của SNPs chống lại Salmonella

Độc tính tế bào

Để đánh giá độc tính của nano bạc đối với tế bào PAM, SNPs ở các nồng độ khác nhau đã được thêm vào giếng tế bào để quan sát sự phát triển của chúng. Bố trí của bài kiểm tra độc tính tế bào trong một đĩa 96 giếng được mô tả trong Hình 4. Mỗi cột có 7 giếng cho mỗi nồng độ SNP (hàng A đến G) và giếng thứ 8 (hàng H) là một ô trống. có SNP để kiểm soát. Tác dụng độc hại được quan sát thấy ở nồng độ SNP 1,56 ppm với khoảng 70% tế bào bị vô hiệu hóa. Trên 1,56 ppm, SNPs cho thấy độc tính cao với 100% tế bào bị vô hiệu hóa, trong khi ở nồng độ loãng hơn (≤0,78 ppm), tác dụng độc hại không được quan sát thấy với hơn 80% tế bào phát triển bình thường. Quan sát bằng kính hiển vi (Hình 5) cho thấy các tế bào trong đối chứng có dạng hình cầu rõ ràng, tương tự như các mẫu được xử lý với nồng độ SNP từ 0,78 ppm trở xuống, trong khi các tế bào trong đối chứng có hình cầu. Trong các mẫu được xử lý bằng nano bạc từ 1,56 ppm trở lên, nó được phân chia rõ ràng. Điều này khẳng định rằng SNP ở nồng độ 0,78 ppm trở xuống không gây độc cho tế bào PAM.

Độc tính do Ag + gây ra đã được nghiên cứu trong hơn 50 năm và cơ chế của nó đã được biết đến với sự đồng thuận chung rằng ty thể là mục tiêu chính của Ag +. Ti thể dễ bị tổn thương bởi “con đường chuyển tiếp tính thấm”, đặc trưng bởi sự hình thành các lỗ protein trong màng ti thể. Mức thấp nhất đối với Ag + có thể gây ra các tác dụng phụ trong tế bào động vật có vú là từ 222 đến 362 mg Ag / Kg * ngày [58]. Độc tính gây ra bởi SNPs không tương tự như Ag +, có một số yếu tố cho phép SNP gây ra tác động độc hại lên tế bào và sinh vật. SNPs có thể xuyên qua thành và màng tế bào và sau đó giải phóng Ag + nội bào. Ag + ở đây có thể tương tác trực tiếp với DNA để gây ra các hiệu ứng độc tế bào và độc tính gen do sự gián đoạn vận chuyển tế bào và làm cạn kiệt glutathione và các chất chống oxy hóa khác [59, 60]. Nanosilver có thể kích thích sản xuất ROS và giảm sản xuất ATP, gây ra stress oxy hóa và các hiệu ứng gây độc gen. Vì hầu hết các hiệu ứng độc hại xảy ra trong tế bào, người ta tin rằng độc tính của nano bạc phụ thuộc vào kích thước; có thể độc hơn ở các hạt nhỏ hơn, đặc biệt là các hạt có kích thước ≤5nm [61].

Độc tính của nano bạc phụ thuộc vào nồng độ và ảnh hưởng của nó có thể khác nhau đối với loại tế bào [59]. Tỷ lệ sống sót của tế bào RAW 246,7 giảm 20% và 40% ở nồng độ SNPs lần lượt là 0,2 và 1,6 ppm [62]. Độc tính cũng được quan sát thấy trong các dòng tế bào gan chuột (BRL 3A) ở nồng độ SNPs từ 1 đến 25 ppm [63]. Ngưỡng độc tính của SNPs đo được trong tế bào HeLa và U937 là 2 ppm sau 4 giờ điều trị [64]. Tuy nhiên, không có độc tính nào được tìm thấy trên tế bào HepG2 ở nồng độ SNPs từ 0,01 đến 5ppm [65]. Quan sát bằng kính hiển vi trên da của lợn được điều trị bằng SNP trong 14 ngày cho thấy độc tính của chúng trên da lợn là một phản ứng phụ thuộc vào nồng độ [66]. Phù nề nội bào và gian bào nhẹ được tìm thấy ở da được điều trị bằng SNPs 0,34 ppm (kích thước 20 nm) và viêm da khu trú nghiêm trọng được quan sát thấy khi mức SNP tăng lên 34 ppm. Rõ ràng, độc tính của SNP thay đổi đáng kể với các dòng tế bào khác nhau, do đó, tùy thuộc vào mục đích ứng dụng của chúng; Nên khảo sát ngưỡng gây độc trên các dòng tế bào liên quan. Trong nghiên cứu này, ngưỡng độc tính quan sát được (0,78 ppm) cho phép chúng tôi nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính kháng virus của các hạt nano bạc trên virus ASF đồng thời tránh sự phá hủy các tế bào PAM (Alveolar macrophage cells).

Cell toxicity of nano silver

Hình 4. Bố cục của thử nghiệm độc tính tế bào. Mỗi cột có 7 giếng từ hàng A đến G cho mỗi nồng độ SNP và giếng thứ 8 trong hàng H dành cho đối chứng không nano bạc. Màu đỏ cho thấy độc tính cao, gây vô hiệu hóa tế bào, màu vàng cho thấy độc tính với tỷ lệ tế bào bị vô hiệu hóa cao và màu xanh lá cây cho thấy nồng độ SNP an toàn với hơn 80% tế bào còn lại sống.

nano-bac-chong-virus-gay-benh-dich-ta-lon-chau-phi

Hình 5. Hình ảnh đại diện của mẫu đối chứng với các tế bào bình thường (a) và tế bào chết trong mẫu được xử lý bằng SNP ở 3.125 ppm (b). Hình ảnh được chụp trên kính hiển vi LED Leica DM IL ở độ phóng đại 200x.

Hoạt động chống vi rút

Hoạt tính kháng virus của các hạt nano bạc trên ASFV được khảo sát ở nồng độ SNPs là 0,78 ppm, ngưỡng gây độc của SNPs. Bố cục thí nghiệm kháng vi-rút được thể hiện trong Hình 6.

Virus được phát hiện trong tất cả các dung dịch pha loãng khi virus đồng nhất ban đầu không được xử lý bằng SNP (vòng tròn màu xanh lá cây), ngược lại, không có virus nào được tìm thấy trong bản kiểm soát không có virus và không có SNP (vòng tròn màu đỏ). Có thể thấy sự khác biệt trong các mẫu được xử lý với SNP là 0,78 ppm. Không có vi rút nào được phát hiện khi chất đồng nhất trong kho được pha loãng từ 3 log trở lên (Vòng tròn màu đỏ), trong khi nó được quan sát thấy ở tất cả các độ pha loãng dưới 2 log.

Những kết quả này chỉ ra rằng ASFV ở mức ≤103 HAD50 có thể bị ức chế hoàn toàn bởi SNPs ở nồng độ 0,78 ppm. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng tác dụng kháng vi-rút của SNP phụ thuộc vào nồng độ [29, 33, 36, 43, 44], vì vậy tác dụng kháng vi-rút của chúng có thể cao hơn khi nồng độ SNP tăng lên. hướng lên; tuy nhiên, nó có thể gây độc tế bào nhiều hơn ở nồng độ cao hơn. Hình 7 cho thấy hình ảnh của các tế bào bị nhiễm và các tế bào PAM bình thường.

Rõ ràng, nếu không được điều trị bằng nanonosilver, độc lực của nó sẽ gây nhiễm trùng và chết các tế bào PAM. Như có thể thấy trong Hình 7a, các tế bào trong mẫu, nơi vi rút không được xử lý bằng 0,78 ppm SNPs, có hình thái bị thay đổi và cho thấy sự hấp thụ hồng cầu xung quanh các tế bào bị nhiễm. Sự hấp thụ của hồng cầu là do sự tương tác giữa hồng cầu và glycoprotein của virus [67]. Trong khi đó, các tế bào PAM được tìm thấy sống với hình dạng tròn trong và không bị hấp phụ hồng cầu trong các mẫu trắng và trong dịch đồng nhất của virus được pha loãng bằng ≥3 log sau khi xử lý với 0,78 ppm SNPs. (Hình 7b). Kết quả khẳng định khả năng ức chế của SNP đối với ASFV.

Theo các nghiên cứu trước đây, các hạt nano bạc có thể tương tác với glycoprotein capsid gp120 của virus, đặc biệt là các nút glycoprotein, các phần tiếp xúc và dễ tiếp cận hơn trên capsid của virus và do đó ngăn cản sự giao phối giữa các tế bào và tế bào chủ, do đó gây ra hoạt động ức chế hiệu quả chống lại virus [29 –31]. Cơ chế này có thể giải thích tác dụng ức chế vi rút đối với một số vi rút có glycoprotein trên màng hạt bao gồm vi rút cúm A [29-31], vi rút cúm H3N2 [32], và vi rút parainfluenza. loại 3.

SNP cũng có thể ức chế sự hình thành RNA nội bào và virion ngoại bào bằng cách tương tác với DNA hoặc các phần tử virus nghi ngờ của HBV [36]. ASFV là một virus DNA được bao bọc bằng các hạt có đường kính từ 170 đến 190 nm được bao bọc với hơn 50 loại protein bao gồm cả glycoprotein [67]. Do đó, có thể SNPs có thể tương tác với các protein này, đặc biệt là glycoprotein trên màng ngoài, để ngăn chặn sự xâm nhập hoặc sao chép của virus và do đó gây ra sự ức chế virus.

Vì sự ức chế vi-rút dựa trên sự tương tác giữa nano và protein của vi-rút, nên hiệu quả kháng vi-rút phụ thuộc đáng kể vào sự tiếp xúc của các vị trí hoạt động trên cả vi-rút và SNP. Do đó, kích thước của SNPs và các chất hạn chế được sử dụng trong quá trình tổng hợp có thể đóng góp quan trọng vào tác dụng kháng virus của SNPs tạo thành. Gaikwad và cộng sự. đã chứng minh rằng SNP với đường kính trung bình 47 nm và 45 nm do nấm Alternaria và Phoma tạo ra, có khả năng ức chế vi rút thấp (từ 0 đến 40%), trong khi SNP được tạo ra bởi F. oxysporum 24 nm) và C. Indicum ( 45 nm) có tác dụng ức chế lên đến 80% (F. Oxysporium) và 90% (C. Indicum).

Hoạt tính kháng virus cao hơn chống lại RSV cũng có thể đạt được khi SNP được ổn định bởi curcumin so với axit citric [34]. Trong nghiên cứu này, SNP với đường kính trung bình khoảng 14 nm có thể ức chế hoàn toàn ASFV ở mức 103 HAD50 trong ống nghiệm. Tuy nhiên, hiệu quả kháng vi rút thực tế có thể bị ảnh hưởng rất nhiều bởi các chất ô nhiễm tồn tại trong môi trường. Các tác động bất lợi có thể nghiêm trọng hơn khi SNPs được áp dụng để làm sạch và khử trùng chuồng trại vì nhiều hợp chất hữu cơ từ chất thải và chất bài tiết của lợn có thể tương tác mạnh với SNPs.

Để đánh giá ảnh hưởng này đến khả năng khử trùng của SNPs trong chuồng lợn, SNPs 25 ppm được phun lên sàn, tường và vách ngăn của chuồng lợn và sau đó ô nhiễm vi sinh vật trong không khí trước và sau đó. Việc phun thuốc được theo dõi bằng một phương pháp thụ động gọi là lắng đọng [68]. Các thử nghiệm được tiến hành ở 3 chuồng khác nhau cho lợn con, lợn nái và lợn trưởng thành.

Trước khi phun dung dịch SNPs, vi khuẩn phát triển trên đĩa rất nhiều nên không thể đếm được như hình 2 C và D, tuy nhiên, sau khi phun dung dịch SNPs, số lượng vi khuẩn trung bình trên đĩa là 34,95 và 813 cfu / tấm tương ứng với 2674, 5760 và 63914 cfu / m3 không khí ở lợn nái, lợn con và lợn trưởng thành, tương ứng. Kết quả cho thấy ô nhiễm vi sinh vật giảm đáng kể sau khi phun dung dịch SNP 25 ppm. Số lượng vi khuẩn cao hơn ở lợn con và lợn trưởng thành không có nghĩa là hiệu quả khử trùng của nano bạc bị giảm trong những trường hợp đó. Có khả năng là nồng độ vi khuẩn trong không khí thay đổi theo mức độ hoạt động của lợn trong nhà; Hoạt động của lợn tạo ra và bơm nhiều sol khí chứa vi khuẩn vào bầu khí quyển.

Trong chuồng lợn nái, mỗi con được ngăn cách trong một vách ngăn với hoạt động rất hạn chế; nó dành nhiều thời gian hơn để nằm trên sàn và do đó ít gây ra hiện tượng hòa khí với vi khuẩn trong không khí hơn. Kết quả là, ít vi khuẩn được lắng đọng trên đĩa thạch. Trong khi đó, lợn con và lợn trưởng thành được di chuyển tự do trong không gian chuồng gây ra nhiều sương mù vi khuẩn hơn với vi khuẩn được cung cấp vào không khí và kết quả là, nhiều vi khuẩn hơn được tìm thấy trên đĩa thạch. . Các kết quả thu được xác nhận rằng hoạt động khử trùng của SNPs không bị ảnh hưởng đáng kể bởi các chất gây ô nhiễm còn lại trên sàn.

nano-bac-chong-virus-gay-benh-dich-ta-lon-chau-phi

Hình 6. Bố cục của thí nghiệm kháng virus. Các dòng A, B, C, D tương ứng với các ô trống vi rút và không có xử lý SNP (A), các mẫu kiểm soát không có SNP và không có vi rút (B), và các mẫu vi rút được xử lý bằng SNP 0,78 ppm (C và D) tương ứng. Các cột từ 1 đến 7 tương ứng với độ pha loãng 10 nối tiếp của vi rút đồng nhất ở 106 HAD50; Số trừ trong vòng tròn đại diện cho nhật ký pha loãng. Vòng tròn màu xanh lá cây cho biết rằng vi rút sống đã được phát hiện, trong khi vòng tròn màu đỏ cho biết không có vi rút sống nào được phát hiện.

nano-bac-chong-virus-gay-benh-dich-ta-lon-chau-phi

Hình ảnh hiển vi đại diện của tế bào PAM nuôi cấy ASFV (a) và tế bào PAM nuôi cấy với ASFV được xử lý trong dung dịch SNP 0,78 ppm trong 1 giờ (b). Hình ảnh được chụp trên kính hiển vi LED Leica DM IL ở độ phóng đại 200x

SNPs đã được sử dụng rộng rãi như một chất kháng khuẩn trong nhiều ứng dụng từ công nghiệp dệt may, khử trùng nước, đóng gói thực phẩm đến y học [19]. SNP có một số ưu điểm so với các chất khử trùng thông thường. Chúng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ và lâu dài chống lại nhiều loại vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm và vi rút. Chúng có thể dễ dàng kết hợp với các chất nền và vật liệu khác; do đó, chúng có thể được sử dụng ở dạng lỏng hoặc rắn. Do đó, SNP cung cấp một loạt các ứng dụng để khử trùng nước, lọc không khí, khử trùng bề mặt, kem dưỡng da hoặc thuốc mỡ cho da, miếng đệm hoặc vải để chăm sóc vết thương. Nhờ ứng dụng linh hoạt và hoạt động lâu dài, SNP có thể tạo ra một rào cản hiệu quả để làm gián đoạn quá trình truyền ASFV. Điều này cho thấy SNP có thể là một chất khử trùng tiềm năng và là một công cụ hiệu quả để ngăn chặn sự lây lan nhanh chóng của ASFV.

Phần kết luận

Nghiên cứu này đã chứng minh rằng nano bạc là một chất khử trùng hiệu quả chống lại cả Salmonella và ASFV. Sự ức chế hoàn toàn của Salmonella và ASFV được quan sát thấy ở nồng độ SNP là 25 ppm và 0,78 ppm và ở nồng độ vi khuẩn là 108 CFU / mL và hiệu giá của vi rút tương ứng là 103 HAD50. SNPs không cho thấy độc tính tế bào đối với tế bào PAM ở nồng độ 0,78 ppm. Kết quả xác nhận rằng SNP có khả năng kháng virus mạnh mẽ chống lại ASFV và có thể là một công cụ đầy hứa hẹn để chống lại căn bệnh này trên quy mô lớn. Kiểm soát sự lây lan của ASFV, ngoài việc cần có vắc xin hiệu quả, cần thực hiện nhiều biện pháp an toàn sinh học để cách ly khu vực ổ dịch, khử trùng nơi lây nhiễm và tạo ranh giới. bảo vệ cho khu vực không bị nhiễm bệnh.

SNP có thể đóng góp lớn vào việc thực hiện các biện pháp an toàn sinh học; tuy nhiên, việc sử dụng SNP nên được kết hợp với các biện pháp phòng ngừa hiện có để tối ưu hóa chi phí và hiệu quả của chúng. Do đó, các nghiên cứu chuyên sâu hơn, đặc biệt là các nghiên cứu thực địa, cần được thực hiện để đạt được sự kết hợp hiệu quả giữa SNP với các biện pháp phòng ngừa hiện có và giảm chi phí cho các biện pháp phòng ngừa.

Reference:

Silver nanoparticles as potential antiviral agent against the African swine fever virus

Tran Thi Ngoc Dung a,*, Vu Nang Nam a, Tran Thi Nhan a, Trinh Thi Bich Ngocb, Luu Quang Minh c, Bui Thi To Nga b, Van Phan Le b,**, Dang Viet Quang d

a Institute of Environmental Technology, Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi, Vietnam

b College of Veterinary Medicine, University of Agriculture of Vietnam, Hanoi, Vietnam

c Ministry of Science and Technology (MOST), Vietnam

d Faculty of Biotechnology, Chemical and Environmental Engineering, Phenikaa University, Hanoi 12116, Vietnam

Related Posts

Trang web này sử dụng cookie để cải thiện trải nghiệm của bạn. Chúng tôi sẽ cho rằng bạn đồng ý với điều này, nhưng bạn có thể chọn không tham gia nếu muốn. Chấp nhận Đọc thêm

error: Content is protected !!
0907 771 622