Trang chủ Kiến thứcNông nghiệp Ứng dụng của Nano đồng trong việc kiểm soát côn trùng và sâu bọ

Ứng dụng của Nano đồng trong việc kiểm soát côn trùng và sâu bọ

Nano Việt
45 views

Bất chấp những phát triển vượt bậc trong lĩnh vực nông nghiệp và năng suất cây trồng trong những thập kỷ qua, mối quan tâm về việc kiểm soát dịch hại nông nghiệp vẫn còn liên tục. Tuy nhiên, quản lý dịch hại dự kiến ​​sẽ có nhiều tác dụng hơn từ vật liệu nano bằng cách cung cấp các giải pháp sáng tạo. Nghiên cứu hiện tại xác nhận sự biến đổi sinh học của các hạt nano đồng (CuNPs) bằng cách sử dụng chiết xuất nuôi cấy không tế bào của vi khuẩn kháng đồng kim loại Pseudomonas fluorescens MAL2, được phân lập từ đất nhiễm kim loại nặng thu thập từ Sharqia Governorate, Ai Cập. Dòng vi khuẩn được sàng lọc cục bộ, Pseudomonas fluorescens MAL2, tương tự như Pseudomonas fluorescens DSM 12442T DSM. Sau khi tối ưu hóa các điều kiện tăng trưởng, môi trường F-Base được tìm thấy là môi trường tốt nhất và pH 7, nhiệt độ 35 ° C, nồng độ CuSO4 · 5H2O 300 ppm, 10 mL chất nổi: 40 mL CuSO4 · 5H2O (300 ppm), và phản ứng Thời gian 90 phút được ghi nhận là điều kiện sinh trưởng tốt nhất để chế tạo CuNPs.

Các hạt nano đồng được tạo thành được đặc trưng bằng cách sử dụng quan sát ban đầu bằng mắt thường về sự thay đổi màu sắc của hỗn hợp phản ứng từ màu xanh lam sang màu xanh lá cây đậm như một dấu hiệu của sự chuyển đổi sinh học CuNPs. Sau đó, quang phổ UV – Vis cho thấy sự hấp thụ cực đại ở bước sóng 610 nm trong các điều kiện tối ưu được thực hiện. Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho thấy sự hình thành của khía cạnh hình cầu với dải kích thước từ 10,70 nm; hơn nữa, quang phổ tia X phân tán năng lượng (EDX) chỉ ra sự hiện diện của nano đồng và các nguyên tố khác. Ngoài ra, sự hiện diện của rượu, phenol, anken và amin được xác nhận bằng phân tích quang phổ quang phổ Fourier-Transform Infrared (FTIR).

Tán xạ ánh sáng động (DLS) hỗ trợ rằng kích thước trung bình Zeta của hạt nano là 48,07 với giá trị PdI 0,227. Điện thế Zeta cho thấy −26,00mV với một đỉnh duy nhất. Các hạt nano đồng sinh tổng hợp (Bio CuNPs) cho thấy độc tính đối với sâu hại hạt lưu trữ (Tribolium castaneum), trong đó giá trị LC50 là 37 ppm sau 5 ngày xử lý. Tuy nhiên, ảnh hưởng không đáng kể được quan sát thấy khi tổng hợp hóa học CuNPs (Ch CuNPs) ở cùng nồng độ. Các kết quả cho thấy rằng Bio CuNPs có thể được sử dụng không chỉ như một tác nhân kiểm soát sinh học mà còn là một phương pháp tiếp cận thân thiện với môi trường và không tốn kém để kiểm soát các loài gây hại hạt lưu trữ.

1. Giới thiệu nghiên cứu

Trong thập kỷ qua, nhiều thí nghiệm thăm dò đã được tiến hành để chứng minh hiệu quả của tác động mạnh mẽ của công nghệ nano và các ứng dụng của nó [1,2]. Kích thước của các hạt nano rắn nằm trong khoảng từ 1 đến 100 nm [3,4,5]. Các hạt nano đồng (CuNP) đã được sử dụng trong các ứng dụng đầy đủ như nông nghiệp, y học, môi trường, kỹ thuật công nghiệp và các lĩnh vực công nghệ khác nhau. Gần đây, các nghiên cứu trong lĩnh vực nông nghiệp nhấn mạnh ảnh hưởng của một số yếu tố đơn giản liên quan đến tính kinh tế của thực vật [4,5,6,7]. Sự kết hợp các nguyên lý sinh học với các phương pháp hóa học và vật lý khác nhau được gọi là công nghệ nano sinh học sản xuất các hạt nano với các chức năng cụ thể [8,9]. Tổng hợp hóa học của các hạt nano là một phương pháp rất tốn kém, và nó được coi là độc hại với năng suất thấp. Sau đó, các phương pháp tổng hợp sinh học từ thực vật hoặc vi sinh có ứng dụng hấp dẫn vì chúng không tốn kém, an toàn, nhanh chóng và thân thiện với môi trường [8,9,10].

Sự biến đổi sinh học của NPs bằng cách sử dụng vi sinh đã thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu vì những phẩm chất nội tại và các ứng dụng tiềm năng của nó trong các lĩnh vực khác nhau. Mỗi vi sinh vật có một cơ chế đặc trưng để hình thành các hạt nano [11]. Các ion mục tiêu từ môi trường được bám trên bề mặt hoặc bên trong tế bào vi sinh vật, và sau đó các enzym của tế bào có thể giảm kích thước ion kim loại thành hạt nano bằng tương tác tĩnh điện [12]. CuO NP có thể được tổng hợp từ vi khuẩn Gram âm, thuộc giống Serratia [13]. Pseudomonas stutzeri không gây bệnh có thể tạo ra CuNP hình cầu với dải kích thước từ 8 đến 15 nm; tuy nhiên, nó có thể tổng hợp các CuNP lập phương có kích thước từ 50 đến 150 nm từ nước thải mạ điện [14]. Hơn nữa, Escherichia coli có thể tổng hợp các NP CuO với kích thước và hình dạng thay đổi [15]. Hiện nay, ngày càng có nhiều mối quan tâm đến việc sử dụng công nghệ nano trong nông nghiệp cho một số mục đích như tăng cường khả năng hấp thụ và phân phối chất dinh dưỡng, phát hiện bệnh và cải thiện việc cung cấp thuốc trừ sâu đến các địa điểm mục tiêu; do đó, nó có thể nâng cao hiểu biết của chúng ta về sinh học của cây trồng [16,17].

Vai trò thiết yếu của các hạt nano đối với việc kiểm soát động vật chân đốt nông nghiệp và các loài gây hại trong y tế-thú y đã được báo cáo [18]. Động vật chân đốt đại diện cho nhóm động vật phong phú nhất trong giới động vật với tầm quan trọng cơ bản về kinh tế. Động vật chân đốt bao gồm côn trùng thực vật và các loài ve có thể phá hủy không chỉ cây trồng mà còn cả các sản phẩm nông nghiệp được lưu trữ [19]. Bọ cánh cứng màu đỏ, Tribolium castaneum Herbst (Coleoptera: Tenebrionidae), là một loài gây hại sản phẩm lưu trữ toàn cầu, đặc biệt lưu trữ trong ngũ cốc và thực phẩm [20], làm hỏng chất lượng và số lượng của chúng [21]. Loài bọ này gây ra sự thiếu hụt đáng kể về trọng lượng và thành phần dinh dưỡng của hạt, làm giảm giá trị thương phẩm và giảm tỷ lệ nảy mầm của hạt [22]. T. castaneum đã được sử dụng trên toàn cầu như một sinh vật mẫu trong các nghiên cứu về thuốc trừ sâu và chất độc sinh thái [23]. Các hạt nano đồng (CuNPs) thể hiện hoạt tính diệt nấm và diệt côn trùng đối với sâu bệnh hại cây trồng. Chúng có thể được sử dụng làm thuốc trừ sâu nano dựa trên CuNP, thuốc diệt cỏ nano và phân bón nano [24].

Do đó, cuộc điều tra hiện tại mô tả sự biến đổi sinh học của CuNPs bằng cách sử dụng Pseudomonas huỳnh quang kháng đồng kim loại trong các điều kiện tăng trưởng được tối ưu hóa, và nó làm sáng tỏ đặc điểm của các CuNP được tạo ra bằng các kỹ thuật tiên tiến hiện có, cũng như điều tra các nguồn sinh học CuNPs và hoạt tính diệt trừ thuốc trừ sâu tiềm năng của chúng chống lại dịch hại kho (T. castaneum).

2. Vật liệu và phương pháp

Các mẫu đất bị ô nhiễm kim loại được thu thập từ các địa điểm khác nhau bên cạnh một số nhà máy kim loại ở Sharqia Governorate, Ai Cập. Chúng được trộn lẫn và được coi là nguyên liệu nguồn để phân lập vi khuẩn. Việc phân lập vi khuẩn kháng kim loại (Cu) được thực hiện bằng kỹ thuật đĩa Replica sử dụng đĩa thạch dinh dưỡng (NA) bổ sung 100 ppm dung dịch CuSO4 · 5H2O đã lọc và khử trùng được ủ ở 37 ° C trong 48 giờ, và chúng được quan sát thấy sự hiện diện của sự phát triển của vi khuẩn [25], sau đó các dòng phân lập được nuôi cấy phục hồi được coi là vi khuẩn kháng đồng. Chỉ có ba chủng vi khuẩn phân lập được phục hồi vì các khía cạnh tốt của chúng và sự phân bố trên các đĩa. Các dòng vi khuẩn (MAL1, MAL2, và MAL3) đã phải trải qua một quá trình sàng lọc, được thực hiện để chọn ra dòng tốt nhất sinh tổng hợp các hạt nano đồng.

2.1. Sàng lọc để tổng hợp các hạt nano đồng

Tất cả các phân lập vi khuẩn kháng kim loại (Cu) đã được nghiên cứu thêm về chất lượng để tổng hợp hạt nano đồng [25,26]. Các mẫu cấy được nuôi cấy riêng biệt ở pH 7 và 37 ° C trong 24 giờ trong môi trường Luria-Bertani (LB). Tế bào vi khuẩn được tách bằng ly tâm ở tốc độ 20.000 vòng / phút trong 10 phút. Vật liệu lọc không có tế bào được tách ra và được sử dụng để tổng hợp ngoại bào các hạt nano.

Đối với tổng hợp hạt nano, khoảng 10 mL phần nổi phía trên từ mỗi mẫu cấy không có tế bào được trộn riêng lẻ với 40 mL 100 ppm dung dịch CuSO4 · 5H2O đã lọc và khử trùng (tỷ lệ 1: 4) trong bình nón 250 mL chứa 100 mL hỗn hợp phản ứng và được đặt trong máy lắc ủ 120 vòng / phút (Máy lắc môi trường LAB — Dòng R ORBIT, AK, Hoa Kỳ) ở 37 ° C trong vòng 24 giờ. Việc sàng lọc định tính sự hiện diện của các hạt nano đồng được thực hiện bằng cách quan sát bằng mắt thường định kỳ để kiểm tra sự thay đổi màu sắc, trong đó màu sắc chuyển từ xanh lam sang xanh lục đậm. Sự xuất hiện của màu xanh đậm hoặc đậm trong bình cho thấy sự biến đổi sinh học của CuNP trong hỗn hợp phản ứng [27], cũng có một bộ bình không có CuSO4 · 5H2O được duy trì như đối chứng.

2.2. Nhận dạng phân lập vi khuẩn

Dòng phân lập được chọn đã được xác định theo các đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh lý của chúng thông qua các xét nghiệm được chỉ định trong Sổ tay Vi khuẩn học Hệ thống của Bergey’s et al. [28]. Sau đó, nó được xác định ở cấp độ phân tử bằng phương pháp khối phổ ion hóa có hỗ trợ ma trận (MALDI TOF, VITEK MS RUO; bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) [29], để xác nhận danh tính trước đây của các vi khuẩn cô lập.

2.3. Sinh tổng hợp CuNPs bởi Pseudomonas fluorescens

Vi khuẩn phân lập được, Pseudomonas fluorescens MAL2, được nuôi trong các bình môi trường F-Base (môi trường Kings B), có chứa peptone, 20 g / L; K2HPO4, 1,5 g / L; MgSO4, 1,5 g / L; Agar, 15 g / L và glycerol, 10 mL pH 7,2, trong đó các bình được ủ ở 30 ° C và 150 vòng / phút để ủ (Lab-line® Incubator-Shaker-ORBIT-USA, Suite D Annapolis Junction, MD 20701, USA ). Chỉ sau 48 giờ, môi trường nuôi cấy được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng / phút trong 20 phút ở 30 ° C để thu thập viên tế bào và dịch chiết không có tế bào [27].

Một gam viên tế bào được lơ lửng riêng biệt trong 20 mL dung dịch CuSO4 · 5H2O (100, 300, 500, 700 và 900 ppm). Một số thể tích thay đổi (10, 20, 10, 40, 40 và 50mL) của chất nổi không có tế bào cũng được thêm vào một số nồng độ (100, 300, 500, 700 và 900 ppm) của dung dịch CuSO4 · 5H2O trong các bình nón đã chuẩn bị. . Sau đó, tất cả các bình được đặt trong tủ ấm lắc trong 24 đến 48 giờ ở 35 ° C và 150 vòng / phút, và sau đó chúng được nghiên cứu về sự biến đổi sinh học CuNPs bằng cách sử dụng phân tích UV – Vis (400–800 nm ”kiểu Laxco ™, Alpha-1502 Alpha Máy quang phổ dòng (Mettler-Toledo, LLC 1900 Polaris Parkway Columbus, OH 43240S) ”, 200–1000 nm [30].

2.4. Tối ưu hóa chuyển đổi sinh học CuNPs

Sáu thông số khác nhau, tức là loại môi trường, nồng độ CuSO4 · 5H2O, các thể tích khác nhau của chất nổi không có tế bào, giá trị pH, thời gian phản ứng và nhiệt độ đã được kiểm tra để đạt được điều kiện phát triển tối đa cho quá trình sinh tổng hợp CuNP, trong đó chỉ có một yếu tố biến, trong khi các yếu tố khác không đổi. Chất cấy Pseudomonas fluorescens MAL2 (2,5 × 106 CFU / mL) được chuẩn bị và cấy vào ba bình môi trường khác nhau): Môi trường dinh dưỡng (NB), Môi trường F-Base (Môi trường Kings B), và Môi trường Luria – Bertani (LBB), và sau đó ủ ở 30 ° C và 150 vòng / phút trong 48 h. Các nồng độ khác nhau của CuSO4 · 5H2O (100, 300, 500, 700 và 900 ppm) được thêm vào chất nổi không có tế bào đã chuẩn bị. Sau đó, nồng độ tối ưu được ghi lại từ dung dịch (CuSO4 · 5H2O) được thêm vào chất nổi không có tế bào ở các giá trị pH khác nhau (4, 5, 6, 7, 8 và 9), và sau đó được ủ ở 30 ° C.

Các giá trị được ghi lại từ các thông số tinh hoàn trước đó được sử dụng để xác định tỷ lệ trộn của chất nổi không có tế bào với CuSO4 · 5H2O (10:50, 20:40, 10:40, 40:10, 40:20 và 50:10) . Cuối cùng, thời gian phản ứng (30, 60, 90, 150 và 180 phút) cũng được nghiên cứu bằng cách sử dụng các thông số khác nhau đã được tối ưu hóa. Các mẫu phản ứng hỗn hợp thu được được phân tích vào những thời điểm thích hợp bằng phân tích quang phổ UV – Vis (mẫu 400–800 nm “Laxco ™, Alpha-1502 Alpha Series (Mettler-Toledo, LLC 1900 Polaris Parkway Columbus, OH 43240)” Máy quang phổ, 200 –1000 nm [30] Sau khi tối ưu hóa các thông số đo được, các giá trị ghi lại được áp dụng chung trong một thí nghiệm để tạo ra CuNP, quá trình tách và tinh chế.

2.5. Đặc tính của các hạt nano đồng

Ban đầu, sự hình thành CuNPs được ghi lại bằng cách quan sát bằng mắt thường sự thay đổi màu sắc. Sau đó, các CuNP được hình thành một lần nữa được đặc trưng bởi quang phổ UV – Vis, phản ứng hỗn hợp đã chuẩn bị được theo dõi bằng máy quang phổ chùm tia kép Laxco ™ (Mettler-Toledo, LLC 1900 Polaris Parkway Columbus, OH 43240), model Laxco ™, Alpha-1502 Alpha Series Máy quang phổ (Mettler-Toledo, OH 43240), 200–1000 nm) [30] để phát hiện cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) của đỉnh hấp thụ thu được đối với CuNP. Phân tích quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) được thực hiện theo [31] (Bruker Tensor 37, Kaller, Đức).

Hơn nữa, huyền phù của CuNP được làm khô [32] và tiếp xúc với EDX bằng JEOL MODEL JSM-IT200 Series (Peabody, MA 01960, USA) [33]. Hình thái và kích thước của CuNPs được xác định bằng TEM. Để đạt được mục đích này, một phần của huyền phù nước của CuNPs được chuyển vào lưới đồng phủ carbon vô định hình, để khô, và được khảo sát bằng cách sử dụng TEM JEOL 1010, Nhật Bản, theo [34]. Một máy phân tích Zetasizer (Nano “Z2 Malven, Malvern Hills, Vương quốc Anh”), để phân tích tiềm năng của Zeta, đã được sử dụng theo công việc tại [35].

2.6. Tổng hợp hóa học của CuNPs

Các hạt nano đồng được tổng hợp bằng cách sử dụng một phương pháp khử hóa học được mô tả trong [36].

2.7. Nuôi côn trùng

Bọ bột đỏ, T. castaneum, được nuôi trên hạt lúa mì xay trộn với 5% men khô trong điều kiện phòng thí nghiệm 32 ± 2 ° C và 68 ± 2% rh., Và 12:12 giờ (Sáng: Tối). Bọ cánh cứng trưởng thành được sử dụng trong thí nghiệm kiểm tra sinh học là 7-14 ngày tuổi.

2.8. Thử nghiệm sinh học côn trùng

Hiệu quả của quá trình sinh tổng hợp và hóa học của CuNP chống lại T. castaneum đã được thử nghiệm ở sáu nồng độ khác nhau (300, 250, 200, 150, 100 và 50 μg mL-1), được chuẩn bị bằng cách pha loãng với nước cất. Nước cất được sử dụng như một phương pháp điều trị đối chứng tiêu cực. Các vật liệu quy trình được sử dụng trong quá trình sinh tổng hợp các hạt nano đồng (Pseudomonas trên bề mặt và CuSO4 · 5H2O với nồng độ 300 ppm) được đánh giá là một đối chứng tích cực. Hai mililit của mỗi nồng độ được thêm cẩn thận vào 20 g hạt lúa mì và lắc để phân bố đồng đều nồng độ đã sử dụng trên hạt lúa mì, sau đó để khô trong không khí. 20 người lớn đã được tiếp xúc với từng nồng độ riêng biệt. Ba lần lặp lại được thực hiện trong tất cả các thí nghiệm. Tỷ lệ tử vong của người lớn được ghi nhận sau 24 giờ cho đến ngày thứ năm.

3. Phân tích thống kê

Phân tích probit, theo công trình trong [37], sử dụng phần mềm IBM SPSS (Armonk, NY 10504-1722, USA, phiên bản 20) được sử dụng để phân tích phản ứng nồng độ-tử vong. Giá trị LC50 cho mỗi khoảng thời gian phơi nhiễm và giới hạn ăn thịt của chúng đã được ước tính. Tỷ lệ tử vong kiểm soát bằng 0 và không cần điều chỉnh.

4. Kết quả và thảo luận

4.1. Phân lập vi khuẩn kháng kim loại từ đất

Từ quá trình phân lập, quan sát thấy rằng trong số các khuẩn lạc được nuôi cấy, chỉ có ba chủng phân lập được phục hồi trên cơ sở sự phát triển tốt và các khía cạnh của chúng trên đĩa thạch dinh dưỡng được bổ sung nồng độ 100 ppm của CuSO4 · 5H2O. Do đó, chúng được coi là các phân lập vi khuẩn kháng đồng, và chúng có khả năng sinh tổng hợp các CuNP. Các phát hiện về sự tồn tại của vi khuẩn kháng đồng trong đất nhiễm đồng phù hợp với Altimira et al. [38], vì họ đã phân lập được vi khuẩn kháng bạc từ các khu vực bị ô nhiễm kim loại nặng. Các phân lập đất kháng đồng, cho thấy sự phát triển khi có CuSO4 · 5H2O, được nhuộm bằng vết Gram. Kết quả khẳng định sự hiện diện của các dạng hình thái tương tự như trực khuẩn ngắn với nhiều cách sắp xếp khác nhau và ba loài trực khuẩn Gram âm được quan sát và nghiên cứu nghiêng.

4.2. Sàng lọc để tổng hợp các hạt nano đồng

Phần nổi không có tế bào của tất cả các phân lập vi khuẩn kháng đồng được xử lý riêng biệt với 100 ppm dung dịch CuSO4 · 5H2O đã lọc và khử trùng. Sau thời gian ủ, các hỗn hợp phản ứng trong các bình nuôi cấy được quan sát thấy chuyển màu từ xanh lam sang xanh đậm (Hình 1). Chỉ có một mẫu phân lập trong số ba mẫu cho thấy rõ ràng quá trình tổng hợp CuNP. Mẫu phân lập thứ hai cho thấy sự tổng hợp CuNPs nhanh chóng trong vòng một giờ, trong khi mẫu thứ nhất và thứ ba không có khả năng tổng hợp CuNPs. Những phát hiện này phù hợp với những phát hiện thực nghiệm của Zaki et al. [39]. Các tác giả nói trên đã báo cáo rằng sự thay đổi màu sắc từ xanh lam sang xanh đậm là do quá trình sinh tổng hợp CuNPs. Từ kết quả sàng lọc định tính nhà sản xuất CuNPs, cũng có thể cảm nhận được rằng đặc tính có các đặc điểm kháng đồng giữa các chủng không được coi là quyết định hoặc chỉ thị cuối cùng duy nhất cho sự biến đổi sinh học của CuNPs. Dòng phân lập được sàng lọc định tính được đề cử là Pseudomonas fluorescens MAL2 với tư cách là nhà sản xuất CuNPs và được xác định phân tử.

Ứng dụng của Nano đồng trong việc kiểm soát côn trùng và sâu bọ

Hình 1: Quan sát sự thay đổi màu sắc trong hỗn hợp phản ứng của Pseudomonas fluorescens MAL2 trong quá trình sinh tổng hợp CuNPs: (A) P. fluorescens MAL2 trong môi trường F-Base. (B) Phần nổi chiết xuất không tế bào. (C) Dung dịch CuSO4 · 5H2O. (D) Một gam viên tế bào cho vào CuSO4 · 5H2O. (E) Sự thay đổi màu của hỗn hợp sau phản ứng từ xanh lam sang xanh lục sẫm chứng tỏ sự tạo thành các CuNP.

4.3. Xác định vi khuẩn được sàng lọc

Vi khuẩn được sàng lọc là Gram âm, di động, hình que ngắn và không hình thành bào tử dưới kính hiển vi ánh sáng, và hiếu khí trong nhu cầu oxy của nó. Về kết quả hình thái học và các xét nghiệm sinh học được tiến hành trên vi khuẩn đã chọn theo quy trình được khuyến nghị trong Sổ tay hướng dẫn của Bergey [40] và quy trình so sánh, được tổ chức theo khía cạnh này, có thể suy ra rằng chủng phân lập tại chỗ là Pseudomonas fluorescens, và nó là ký hiệu là Pseudomonas fluorescens MAL2. Sau đó, nó được tiếp xúc một lần nữa để xác định nhanh và chính xác bằng Máy khối phổ MALDI TOF (VITEK MS RUO; bioMérieux, Marcy l’Etoile, Pháp). Các kết quả đã đăng ký cho thấy độ tương đồng tối đa của nó là 98% với một số Pseudomonas spp. chủ yếu là Pseudomonas fluorescens DSM 12442T DSM [38]. Do đó, phân lập vi khuẩn được sàng lọc cục bộ (Pseudomonas fluorescens MAL2) tương tự như Pseudomonas fluorescens DSM 12442T DSM.

4.4. Các yếu tố tối ưu hóa

4.4.1. Loại Trung bình Ba môi trường khác nhau

Môi trường dinh dưỡng (NB), Môi trường F-Base (Môi trường Kings B), và Môi trường Luria – Bertani (LBB) —được sử dụng để khám phá loại môi trường tốt nhất trong thí nghiệm này. Phổ UV – Vis của CuNP do vi khuẩn thử nghiệm tạo ra sau khi ủ và phát triển trong ba môi trường khác nhau được trình bày trong Hình 2A. Độ hấp thụ trong trường hợp NB là 0,81 nm, trong khi đó là 1,43 nm trong trường hợp môi trường F-Base và độ hấp thụ này trong LBB là 1,19 nm ở 650 nm. Môi trường F-Base được coi là môi trường tốt nhất để chế tạo CuNPs bằng cách sử dụng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens MAL2 đã được thử nghiệm. Đối với loại trung bình, môi trường F-Base được coi là môi trường tốt nhất để chế tạo CuNPs bởi Pseudomonas fluorescens MTCC 103 [41].

An external file that holds a picture, illustration, etc.
Object name is nanomaterials-10-00587-g002.jpg

Hình 2: (A) Phổ UV – Vis thuộc loại trung bình. (B) Phổ UV – Vis của các giá trị pH khác nhau được sử dụng trong quá trình chuyển hóa sinh học CuNPs bởi P. fluorescens MAL2.

4.4.2. Mức độ pH

Người ta biết rằng sự thay đổi giá trị pH có thể kiểm soát hình dạng và kích thước của các NP [42]. Các đỉnh được ghi lại ở pH axit là 4, 5 và 6 trên các phương tiện truyền thông cho thấy rằng độ pH thấp làm giảm sự chuyển hóa sinh học của CuNPs. PH thấp không tạo điều kiện cho quá trình chuyển đổi sinh học CuNPs (Hình 2B). PH kiềm thể hiện một đỉnh sắc nét ở bước sóng 561 nm, cho thấy sự hiện diện của các hạt hoặc tập hợp có kích thước lớn hơn. Tăng hoặc giảm độ kiềm có thể dẫn đến kết tụ hoặc thay đổi các hạt nano tương tự như vậy được tìm thấy ở E. coli. Trong thí nghiệm này, ở pH 7, một pic đặc trưng quan sát được ở bước sóng 610 nm chứng tỏ việc chế tạo CuNP. Hình 2B cho thấy pH 7 là tốt nhất để chế tạo NPs. Các hạt nano vàng được biến đổi sinh học ở pH 7 bằng cách sử dụng Rhodopseudomonas capsulate, như He et al đã nêu trước đó. [43]. Shantkriti và Rani [27] báo cáo rằng pH 7 được tìm thấy là pH tối ưu để sản xuất CuNPs bởi Pseudomonas fluorescens MTCC 103.

4.4.3. Mức độ nhiệt độ

Sáu độ nhiệt độ khác nhau đã được thực hiện để nghiên cứu yếu tố này, tức là 25, 30, 35, 40, 45 và 50 ° C. Dễ dàng nhận thấy rằng 35 ° C được ghi nhận là nhiệt độ tối ưu cho sự biến đổi sinh học của CuNPs bởi vi khuẩn Pseudomonas fluorescens MAL2 đã được thử nghiệm (Hình 3A). Các kết quả thu được đã chứng minh rằng sự gia tăng nhiệt độ làm giảm sự sản sinh CuNP và sự giảm này có thể xảy ra do sự bất hoạt hoặc phân hủy của các hợp chất sinh học trong hỗn hợp phản ứng gây ra quá trình cảm ứng sinh học. Khi nhiệt độ phản ứng tăng lên trong hỗn hợp phản ứng, cả tốc độ tổng hợp và chuyển đổi thành các hạt nano đồng trong môi trường đều tăng [44].

An external file that holds a picture, illustration, etc.
Object name is nanomaterials-10-00587-g003.jpg

Hình 3: (A) Phổ UV – Vis ở các nhiệt độ khác nhau được sử dụng. (B) Phổ UV – Vis của nồng độ CuSO4 · 5H2O được sử dụng trong quá trình biến đổi sinh học CuNPs bởi P. fluorescens MAL2.

4.4.4. Nồng độ CuSO4 · 5H2O và phần nổi trên biến đổi sinh học CuNPs

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 · 5H2O, năm nồng độ CuSO4 · 5H2O (100, 300, 500, 700, và 900 ppm Cu) đã được sử dụng như được trình bày trong Hình 3B. Các mẫu đối chứng không cho thấy bất kỳ đỉnh riêng biệt nào trong khoảng từ 550 đến 650 nm và cho thấy không có sự hình thành CuNPs. Khi nồng độ chiết xuất không có tế bào được tăng lên trong hỗn hợp phản ứng lên 700 và 900 ppm Cu, các đỉnh hấp thụ rõ ràng được nhận thấy trong vùng trên 700 nm. Khi 10 mL dịch chiết không có tế bào được thêm vào dung dịch CuSO4 · 5H2O 300 ppm, một đỉnh cụ thể đã được phát hiện; cho thấy 10 mL phần nổi phía trên là đủ để khử các ion đồng trong phản ứng hỗn hợp để tạo thành CuNP. Sự gia tăng hơn nữa thể tích của dịch chiết không có tế bào (40 mL) đến dung dịch đồng 900 ppm dẫn đến độ sắc nét cao nhất với sự kết hợp của CuNPs. Kết quả này phù hợp với Shantkriti và Rani [27], vì họ phát hiện ra rằng khi 10 mL dịch chiết Pseudomonas fluorescens không có tế bào được thêm vào dung dịch đồng sulfat 318,4 ppm, một đỉnh đặc trưng được ghi lại, cho thấy rằng 10 mL tế bào- chiết tự do vừa đủ để khử ion Cu + 2 trong dung dịch để tạo thành CuNP.

4.4.5. Tỷ lệ trộn của chiết xuất không có tế bào và CuSO4 · 5H2O

Sáu thể tích khác nhau từ 300 ppm CuSO4 · 5H2O làm dung dịch gốc được trộn với sáu thể tích khác nhau của chiết xuất không có tế bào của Pseudomonas fluorescens MAL2 (10:50, 20:40, 10: Lần lượt là 40, 40:10, 40:20 và 50:10) và ủ trong 24 giờ ở 35 ° C. Phổ UV – Vis của CuNP đã được ghi lại và được đưa ra trong (Hình 4A). Kết quả cho thấy thể tích 10 mL CuSO4 · 5H2O 300 ppm, được thêm vào với 40 mL dịch chiết không chứa tế bào ở tỷ lệ 1: 4, được coi là tỷ lệ tốt nhất. Vì nó cung cấp độ hấp thụ cuối cùng ở bước sóng 610 nm, sự gia tăng thể tích chất chiết không có tế bào làm giảm độ hấp thụ. Sự suy giảm này chứng tỏ quy mô NPs giảm. Điều này chỉ ra rằng bằng cách tăng lượng dịch chiết không tế bào trong hỗn hợp phản ứng, số lượng và kích thước của NP trở nên nhỏ hơn [45].

An external file that holds a picture, illustration, etc.
Object name is nanomaterials-10-00587-g004.jpg

Hình 4: (A) Phổ UV – Vis của mối quan hệ trộn lẫn của bề mặt nuôi cấy và CuSO4 · 5H2O. (B) Phổ UV – Vis về thời gian ủ được sử dụng trong quá trình tạo sinh học CuNPs bởi P. fluorescens MAL2.

4.4.6. Thời gian phản ứng

Thời gian sản xuất hạt nano là một tính năng quan trọng giúp tăng cường sự ổn định và biến đổi sinh học của NPs. Từ thực nghiệm thời gian phản ứng được thực hiện (30, 60, 90, 120, 150 và 180 phút), người ta thấy rằng độ hấp thụ của các hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 610 nm tăng dần đến 90 phút, và sau đó nó bắt đầu giảm (Hình 4B). Xu hướng này cho thấy rằng sự biến đổi sinh học CuNP xảy ra, với sự gia tăng thời gian phản ứng; quá trình giảm kích thước diễn ra và quá trình biến đổi sinh học CuNP được thực hiện trong điều kiện tối ưu. Để làm rõ quá trình thời gian phản ứng, phổ hấp thụ UV – Vis được ghi lại sau mỗi 10 phút [46].

4.5. Đặc tính của các hạt nano đồng

4.5.1. Phân tích UV

Vis của quá trình sinh tổng hợp CuNP Khi chiết xuất không có tế bào của Pseudomonas fluorescens MAL2 được thêm vào dung dịch CuSO4 · 5H2O trong các bình nuôi cấy và để ủ trong 48 giờ, hỗn hợp phản ứng chuyển màu từ xanh lam sang xanh lục đậm (Hình 5A) , chứng minh sự biến đổi sinh học của CuNPs. Sự xuất hiện tương tự của dung dịch có màu xanh đậm do thêm CuSO4 5 mM vào bình chứa Morganella sp., Cho thấy sự biến đổi sinh học của CuNPs [47,48]. Khi thêm các dung dịch CuSO4 · 5H2O với nồng độ khác nhau vào viên bột, không có sự thay đổi màu sắc nào xảy ra (Hình 5B). Phổ hấp thụ UV-Vis của hỗn hợp phản ứng này thể hiện một đỉnh hấp thụ cụ thể trong khoảng từ 550 đến 650 nm (Hình 6A), có thể là do CuNPs [49]. Vị trí chính xác của dải Cộng hưởng Plasmon bề mặt (SPR) có thể thay đổi, điều này phụ thuộc vào đặc tính của các hạt nano riêng lẻ, bao gồm kích thước, hình dạng và tác nhân đóng nắp [50].

Ứng dụng của Nano đồng trong việc kiểm soát côn trùng và sâu bọ

Hình 5: (A) Sự thay đổi màu sắc trong cường độ của phản ứng tạo thành CuNPs. (B) Không có sự thay đổi màu sắc khi cho 1 g viên tế bào vào dung dịch CuSO4 · 5H2O.

An external file that holds a picture, illustration, etc.
Object name is nanomaterials-10-00587-g006.jpg

Hình 6: (A) Phổ UV – Vis của CuNPs. (B) Máy phân tích quang phổ tia X phân tán năng lượng (EDX) hình ảnh về sự biến đổi sinh học của CuNPs bởi P. fluorescens MAL2.

4.5.2. Phân tích EDX

EDX đã chứng minh rằng CuNP được thiết kế dưới dạng tập hợp và có hình thái biến đổi (Hình 6B). Phân tích EDX đã minh họa rằng 13,21% đồng và 22,55% oxy và một nguyên tố khác có trong các hạt nano. Sự xuất hiện của các nguyên tố khác có thể là do hỗn hợp các thành phần phản ứng hoặc các phân tử sinh học khác do vi khuẩn thử nghiệm tiết ra. Một yếu tố khác xuất hiện cùng với các hạt nano theo các thành phần môi trường được sử dụng trong sự phát triển của vi khuẩn, cũng đã được báo cáo bởi Shantkriti và Rani [27]. Kết quả EDX cho thấy sự hiện diện của các nguyên tố oxy, cacbon, phốt pho, clo, kali và lưu huỳnh trong chất keo tụ sinh học tinh khiết. Sự hiện diện của các nguyên tố oxy, đồng, phốt pho, magiê, canxi, clo và lưu huỳnh trong các hạt nano khi được tổng hợp đại diện cho sự thụ động của các hạt nano đồng với chất keo tụ sinh học [51]. Kết quả EDX xác nhận sự hiện diện của Cu trong một mẫu, đây là dấu hiệu cho thấy chất keo tụ sinh học có thể được sử dụng làm chất đóng nắp trong quá trình chuyển hóa sinh học CuNPs.

4.5.3. Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

TEM được thực hiện để phân tích hình dạng và kích thước của CuNPs [52]. Hình 7A cho thấy hình ảnh TEM của CuNP đạt được sau 48 giờ phản ứng của dịch chiết không tế bào (P. fluorescens MAL2) với CuSO4 · 5H2O; kích thước CuNPs nằm trong khoảng từ 10 đến 70 nm với sự hiện diện của khía cạnh hình cầu. Kích thước của CuNP do Pseudomonas fluorescens tạo ra nằm trong khoảng từ 20 đến 80 nm với sự hiện diện của các NP hình cầu và lục giác. Những kết quả này phù hợp với những báo cáo của Shantkriti và Rani [27]. Từ nghiên cứu của Dlamini et al. [51], hình ảnh TEM thu được cho thấy các hạt nano đồng được tổng hợp, sử dụng chất keo tụ sinh học chiết xuất từ ​​Alcaligenes faecalis HCB2, có hình dạng gần giống hình cầu. Các hạt nano đồng dường như có hình dạng và tập hợp gần giống hình cầu [51].

An external file that holds a picture, illustration, etc.
Object name is nanomaterials-10-00587-g007.jpg

Hình 7: (A) Ảnh hiển vi điện tử TEM của các CuNP. (B) Phân tích FTIR về biến đổi sinh học CuNP của P. fluorescens MAL2.

4.5.4. Phân tích hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR)

Phân tích này cung cấp dữ liệu về các nhóm chức năng được trình bày trong các hợp chất trong bề mặt vi khuẩn tương tác với các ion kim loại. Phổ FTIR của CuNP được tổng hợp bằng cách sử dụng chất nổi Pseudomonas fluorescens MAL2 được thể hiện trong Hình 7B. Sự hiện diện của mười bảy dải tại 3246.56, 2946.30, 2361.57, 2080.70, 1652.08, 1543.21, 1455.66, 1404.91, 1333.52, 1187.28, 1110.59, 1045.80, 989.18, 921.62, 855.88, 620.23 và 562.56 cm-1. Các dải này đại diện cho các nhóm chức khác nhau như amin bậc một và bậc hai, amit, rượu, phenol, và đỉnh mạnh và rộng với các liên kết kéo dài O – H và kéo dài N – H ở 3246,56 cm-1, trong khi ở 2946,30, 2361,57, và 2080,70 cm − 1 cho các pic mạnh và yếu, có các nhóm chức tương ứng là chất thơm và alkyne. Các dải xuất hiện ở 1652,08, 1455,66, 1404,91, và 1333,52 cm-1 lần lượt được gán cho kéo dài –C≡C– và kéo dài C – C (trong vòng) của anken và chất thơm, tương ứng.

Hơn nữa, đỉnh mạnh ở 1543,21 cm-1 tương ứng với dao động kéo giãn không đối xứng N – O của các phân tử nitro. Đỉnh của độ hấp thụ tại 1187,28, 1110,59 và 1045,80 cm − 1 cho thấy sự kéo dài C – O của các hợp chất phenol và ancol. Các đỉnh ở 989,18, 921,62 và 855,88 cm-1 là do sự uốn cong C – H thơm. Đỉnh ở 620,23 cm-1 là theo sự uốn cong C – H thơm. Đỉnh ở 562,56 cm-1 là theo độ căng của kim loại-cacbon. Phân tích FTIR được ghi lại cho thấy rằng CuNPs có thể được bao quanh bởi các phân tử hữu cơ như polyphenol, alkaloid và terpenoit, như đã được báo cáo [53]. Các nhóm cacbonyl của gốc axit amin và một số peptit có khả năng kết đôi mạnh với các NP [54]. Nhiều học giả báo cáo rằng các protein có thể liên kết với NP thông qua các nhóm amin hoặc cysteine ​​tự do trong protein. Những protein này chiếm ưu thế trên bề mặt NPs có thể hoạt động như một tác nhân đóng vai trò ổn định [55].

4.6. Phân tích tán xạ ánh sáng động (DLS)

Kích thước trung bình của các CuNP, sự phân bố kích thước và chỉ số đa phân tán (PDI) của các CuNP chuyển đổi sinh học được ước tính bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS), và kết quả được đưa ra trong Hình 8A. Kết quả cho thấy kích thước CuNPs trung bình là 48,07 nm và chỉ số phân tán là 0,227. Kích thước NP và PDI trung bình cho thấy rằng các CuNP được biến đổi sinh học là đơn phân tán.

An external file that holds a picture, illustration, etc.
Object name is nanomaterials-10-00587-g008.jpg

Hình 8: (A) Sự phân bố kích thước hạt của các CuNP biến đổi sinh học. (B) Tiềm năng Zeta của các CuNP tạo thành sinh học bởi P. fluorescens MAL2.

4.7. Phân tích tiềm năng của Zeta

Để quan sát các điện tích bề mặt do CuNPs thu được, người ta đã tiến hành phân tích điện thế Zeta, có thể được thực hiện để có những hình dung trước rõ ràng về tính ổn định của các CuNP dạng keo được tạo thành. Độ lớn của thế zeta cho ta cái nhìn sâu sắc về tính ổn định vốn có của chất keo. Cần quan sát rằng các hạt CuNP, với giá trị thế zeta dương hơn +30 mV hoặc âm hơn −30 mV, được coi là ổn định [56]. Thế zeta của các CuNP trong nghiên cứu này được tìm thấy là -26,00 mV (Hình 8B), và có thể suy ra rằng các CuNP được biến đổi sinh học rất ổn định [57]. Lực đẩy tĩnh điện giữa các NP phụ thuộc vào điện tích nằm trên bề mặt của các hạt nano. Khi điện tích của các hạt nano là âm, nó không gây ra sự kết tụ của các hạt nano này, gây ra sự ổn định lâu dài.

4.8. Tác dụng độc hại của Nano-Copper trên Tribolium castaneum

Bảng 1 cho thấy tác dụng độc hại của Bio CuNPs đối với T. castaneum so với Ch CuNPs. Tỷ lệ tử vong của T. castaneum trưởng thành tăng lên cùng với sự gia tăng nồng độ Bio CuNPs liên quan đến thời gian tiếp xúc. Cụ thể hơn, LC50 của Bio CuNPs sau 24 giờ tiếp xúc với T. castaneum trưởng thành là 693,7 ppm. Giá trị này giảm đáng kể xuống còn 130,5 và 36,89 ppm lần lượt sau ba và năm ngày. Bên cạnh đó, T. castaneum bị ức chế ở nồng độ Bio CuNPs cao hơn (300 ppm) sau 5 ngày tiếp xúc. Hiệu ứng này có thể là do khả năng của các hạt nano đi qua các tế bào biểu mô và nội mô bằng cách chuyển tế bào [58]. Hơn nữa, các hạt nano có thể dễ dàng di chuyển dọc theo đuôi gai, sợi trục, máu và mạch bạch huyết, gây ra stress oxy hóa và các hiệu ứng khác [59]. Ngược lại, bất kỳ trường hợp tử vong nào của T. castaneum trưởng thành đều được quan sát với Ch CuNPs ở tất cả các nồng độ đã sử dụng.

Ngoài ra, các mẫu đối chứng không cho thấy bất kỳ tỷ lệ tử vong nào. Do đó, rõ ràng là cùng một nồng độ Bio CuNPs và Ch CuNPs không mang lại hiệu quả như nhau trên T. castaneum. Hai lý do có thể giải thích cho tác động tiêu cực của Ch CuNPs: Thứ nhất, nồng độ Ch CuNPs không đủ để tiêu diệt T. castaneum và cần được tăng lên. Giả thuyết này được hỗ trợ thêm bởi Shaker [60], người đã báo cáo tỷ lệ tử vong là 95% khi sâu cuốn lá bông Spodoptera littoralis tiếp xúc với CuO-NP tổng hợp hóa học ở 1000 ppm. Thứ hai, Gudikandula [61] đã chứng minh rằng một chất ổn định nên được thêm vào để tăng cường tác dụng của Ch CuNPs và ngăn ngừa sự kết tụ.

Bảng 1: Phân tích probit cho dữ liệu về tỷ lệ tử vong ở người trưởng thành của Tribolium castaneum được điều trị bằng CuNPs ở giới hạn tin cậy 95%.

Treatments CuNPs Concentration (μg/mL) 300 250 200 150 100 50 LC50 (μg/mL) Chi-square Value
Period %Mortality
Bio CuNPs First day 30 20 17 10 7 3 693.7 0.589
Third day 67 60 50 47 43 43 130.5 1.67
Fifth day 100 93 83 73 70 67 36.89 6.63
Ch CuNPs
Negative Control
(distilled H2O)
Positive Control Pseudomonas supernatant
CuSO4·5H2O

LC50: nồng độ gây chết người giết chết 50% người lớn tiếp xúc; Bio CuNPs: sinh học của các hạt nano Đồng; Ch CuNPs: tổng hợp hóa học của các hạt nano Đồng.

Mặt khác, tác dụng tích cực của các loại hóa chất khác nhau dưới kích thước nano trong việc kiểm soát sinh học chống lại các loài gây hại khác nhau đã được báo cáo trong một số cuộc điều tra. Ví dụ, quần thể của nhện hai đốm, loài gây hại đậu nghiêm trọng nhất, đã giảm đáng kể khi bổ sung viên nang nano CuO [62]. Selvan [63] đã tìm thấy hoạt tính diệt ấu trùng chống lại vectơ truyền bệnh Aedes aegypti khi xử lý bằng CuO-NPs bằng cách sử dụng tổng hợp màu xanh lá cây bằng cách sử dụng chiết xuất từ ​​lá của Tridax procumbens. Bên cạnh đó, người ta đề xuất rằng việc áp dụng công nghệ nano trong các công thức hóa chất nông nghiệp có thể làm giảm lượng hóa dầu được sử dụng trong thuốc trừ sâu [64]. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng sự kết hợp của AgNP với số lượng ít hơn của Malathion tạo ra hiệu quả diệt côn trùng cao để kiểm soát T. castaneum [65].

Xem xét các tác động tích cực của các hạt nano như tác nhân kiểm soát sinh học đã được xác nhận bởi các nghiên cứu nói trên cùng với thực tế là nồng độ của các hạt nano có thể được giảm xuống với tỷ lệ tử vong hiệu quả khi chúng được sản xuất sinh học, có thể kết luận rằng sản xuất sinh học của các hạt nano có thể được coi là một cách tiếp cận thân thiện với môi trường. Kết luận này cũng được ủng hộ bởi Selvan và Gunalan, những người đã chứng minh rằng cả quá trình tổng hợp Cu-NP sinh học và màu xanh lá cây đều nhấn mạnh hiệu quả diệt côn trùng của chúng như một phương pháp thân thiện với môi trường và rẻ tiền [63,66].

Lưu ý rằng ngay cả khi cuộc điều tra hiện tại chứng minh rằng các hạt nano, tức là Cu-NP, có khả năng diệt côn trùng đối với các loài gây hại sản phẩm được lưu trữ, đặc biệt là T. castaneum, thì kết luận tương tự không nên được giả định ở các loài gây hại khác và mỗi loài gây hại phải như vậy. được đánh giá riêng. Chính xác, người ta đã báo cáo rằng ấu trùng T. confusum nhạy cảm hơn với việc tiếp xúc với đất nano-Diatomaceous hơn so với ấu trùng T. castaneum [67]. Ngoài ra, các nghiên cứu sâu hơn vẫn được yêu cầu đối với việc sử dụng nồng độ cao của các hạt nano như vậy. Ví dụ, mặc dù CuO-NP cho thấy tiềm năng loại bỏ alachlor và phenanthrene trong dung dịch nước [68], nồng độ cao của CuO-NP trong dung dịch nước dẫn đến sự tích tụ nhiều trong cơ thể ấu trùng của máy hủy nước ngọt Allogamus ligonifer; trong đó giá trị LC50 là 569 mg L-1 sau 96 giờ tiếp xúc, dẫn đến những tác động tiêu cực đến sự tăng trưởng và hành vi ăn của chúng [69].

5. Kết Luận

Sản xuất hạt nano đồng xanh là một quy trình an toàn, tiết kiệm chi phí và thân thiện với môi trường chống lại các loại côn trùng kinh tế quan trọng nhất như Tribolium castaneum, chúng gây ra thiệt hại đáng kể cho cây trồng xâm nhập vào chuỗi thức ăn của con người và động vật. Chủng Pseudomonas fluorescens được phân lập trong nghiên cứu này cho thấy khả năng tổng hợp hạt nano đồng ở các kích thước từ 10 đến 70 nm. Có thể kết luận rằng các hạt nano đồng được tổng hợp sinh học có hoạt tính diệt côn trùng tuyệt vời ở nồng độ thấp chống lại dịch hại sản phẩm được lưu trữ T. castaneum. Hiệu quả của quá trình tổng hợp sinh học của các hạt nano đồng vượt trội hơn so với hiệu quả tổng hợp hóa học của các hạt nano đồng.

Nguồn: Articles from Nanomaterials are provided here courtesy of Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI)

CÔNG TY TNHH KỸ THUẬT NANO VIỆT

Địa chỉ: Số A12/85 Đường 1A, Ấp 1, Xã Vĩnh Lộc B, Huyện Bình Chánh, TP. HCM

Hotline: 0932 884 877 – 0907 771 622 – 0796 155 955 – 0789 377 177 – 0931 791 133 

Email: sales.nano [email protected]

Fanpage: Nanovnn – Nano bạc nguyên liệu

Related Posts

Trang web này sử dụng cookie để cải thiện trải nghiệm của bạn. Chúng tôi sẽ cho rằng bạn đồng ý với điều này, nhưng bạn có thể chọn không tham gia nếu muốn. Chấp nhận Đọc thêm

error: Content is protected !!
0907 771 622